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可溶 gp140 HIV 包膜三聚物的 9Å 结构与 17b 中和 FAB 片段结合。贝塞斯达国立卫生研究院国立癌症研究所癌症研究中心细胞生物学实验室 S. Subramaniam 友情提供。

冷冻透射电镜的优势

透射电子显微镜如何与蛋白质 X 射线晶体照像和 NMR 互补

蛋白质分子在细胞内执行大部分机能,而其中大多数活动都涉及到多种蛋白质和其他大分子的相互作用。在过去二十年,使用蛋白质 X 射线晶体照像或核磁共振 (NMR) 确定单一蛋白质的方法变得越来越简单。然而,解析蛋白质复合体的结构仍然很困难。蛋白质复合体并非总是能够形成结晶,并且许多大尺寸的复合体很难通过 NMR 进行研究。 

透射电子显微镜 (TEM) 能够确定这些大分子复合体的结构。 TEM 最适合研究 250kDa 或更大的复合体,与个体蛋白质或域的 X 射线晶体照像和 NMR 研究形成互补。最近几年,电子显微镜设计和电子检测科技取得了重大的技术进展,因而使用冷冻透射电镜可达到更高的分辨率,并且在高于 3.5Å 的分辨率下解析了若干蛋白质的结构。蛋白质 X 射线晶体照像、NMR 和 TEM 三者结合,不但能够在高分辨率下解析较小的蛋白质,还能将所有蛋白质复合体作为一个大型的大分子结构进行检查,并且通过某些成分的结构细节和分子建模可以建立完整的原子模型。 冷冻透射电镜还可以研究不均匀样品,并提供其他结构生物学技术难以检查的关于动态和复合体的结构细节。

TEM 如何帮助解决结构生物学中的难题

TEM 是一个强大的工具,提供大分子的直接图像,并可为诸多结构生物学工程提供帮助。TEM 可显现较大复合体的概况,并提供关于大分子复合体的稳定性和动态的信息。当复合体或蛋白质无法结晶时,使用 TEM 通常能够观察其结构,有时达到近原子级分辨率。即使蛋白质复合体也许能够结晶,TEM 也可提供其结构的初始三维模型,该模型可能有助于确定更高分辨率的结构。TEM 提供的宝贵结构信息与其他结构生物学技术提供的数据形成互补,有助于创建更完整的大分子复合体图像,并有助于生成机理模型,以说明其机能。

 

TEM 的主要优势:

  • 无需结晶
  • 对大分子复合体的大小或复杂度没有上限要求
  • 使用最新显微镜和检测器可达到近原子级分辨率
  • 可分析不均匀样品,以便研究动态和不稳定的复合体
  • 只需要蛋白质的显微图即可进行分析
  • 冷冻透射电镜可直观显示完全水化、接近天然态的大分子

 

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如何在结构生物学中运用 TEM

在结构生物学的 TEM 技术中,个体大分子复合体的二维图像是通过透射电子显微镜得到的。 这些二维图像可通过图像处理技术进行数学匹配,以生成大分子的三维体。样品一般包裹在乙酸双氧铀等重金属染料(负染色)中,或者嵌入在玻璃冰中无染色低温成像(冷冻透射电镜)。要制备在冷冻透射电镜下观察的蛋白质,需要将样品滴在具有一系列小孔(尺寸范围 µm)的碳涂层电镜网栅上。然后迅速将网栅浸入液态乙烷或丙烷,冷却至液氮温度。样品必须保持低温,以防出现相变,否则会导致形成晶体冰并损坏样品。随后,在电子显微镜中使制备的样品成像,并使用重建软件根据各个颗粒的图像创建三维结构。虽然各个颗粒是在低对比度下成像的,但通过对数百或数千个颗粒进行平均,生成的结构可以达到极高分辨率。

使用 Falcon 2 直接电子探测器在 FEI Titan Krios 上成像的单纯性疱疹病毒的一片成熟衣壳。衣壳直径为 1250 Å,质量为 > 200 兆道尔顿。美国国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所结构生物学研究实验室 Anastasia Aksyuk、William Newcomb 和 Alasdair Steven 友情提供。

冷冻透射电镜的主要应用:单颗粒分析和断层扫描

单颗粒分析 (SPA) 和断层扫描可在同一个显微镜上进行,并提供互补信息。SPA 可提供分子复合体的高分辨率图像,但缺少生物背景。电子立体成像可提供背景信息,但个体颗粒的分辨率有限。

电子立体成像是一项成熟的技术,可记录各种倾斜角度的图像,随后通过反投影进行三维重构(视频 1)。样品可以是纯化的大分子复合体、整个病毒,甚至是整个细胞。

单颗粒分析 (SPA) 是创建三维图像的另一种方法。大量二维投影图像提供的技术数据包含不同方向的相同大分子副本,结合后可生成该结构的三维重构(视频 2)。 

 

动画由德国马丁雷德生物化学研究所的 Max Planck 友情提供

视频 1:单颗粒分析。先对纯化蛋白质溶液进行玻璃化,随后在电子显微镜中成像。收集数千个颗粒的数据后,进行分类和平均,从而完成大分子的三维重构。 
视频 2:在断层扫描实验中,对不同倾斜角度拍摄的各个二维图像的反投影进行重新构建和平均,以提供样品的三维结构。 

文档

逐步采用综合结构生物学方法:将冷冻透射电镜、X 射线晶体照像和 NMR 相结合

如今,冷冻透射电镜 (CryoTEM),尤其是单颗粒分析,正在快速成为确定蛋白质复合物和病毒的三维结构的主要方法。过去几年来,冷冻透射电镜技术获得突飞猛进的发展,例如自动化程度提高、采用改进的检测器,以及采取更高级的图像处理技术。虽然冷冻透射电镜被一度认为是低分辨率的结构分析技术,此方法目前可在常规研究中生成接近原子级分辨率的结构。此外,通过将冷冻透射电镜与 X 射线晶体照像、核磁共振光谱仪和分子动态建模等其他方法相结合,研究人员可以解决之前被认为相当棘手的科学问题。普遍认为,未来的技术发展将进一步增强这一方法;可以预见,冷冻透射电镜可能会像 X 射线晶体照像那样成为确定蛋白质结构的常规方法。

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